酶聯免疫斑點法是ELISA方法中的一種，目前國內很少客戶用這種方法檢測，一般都是用的雙抗體夾心法及間接法，酶聯免疫斑點法國內很少客戶用這種方法檢測，但是我們也該清楚他們的操作步驟，下面讓我們一起來看看我司錢為客戶準備的酶聯免疫斑點法操作步驟：

1.用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。
2.倒去酒精，用100ul PBS洗滌3次。
3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中，混合，每孔加100ul，蓋上板蓋。
4. 倒去液體，100ul PBS洗滌一次。
5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS(見試劑準備)，蓋上板蓋，室溫下孵育2小時。
6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
7.用100ul PBS洗滌一次。
8.每孔加入100ul細胞懸浮液(含適當量的細胞和相應濃度的刺激劑)。細胞可預先在體外接受刺激(間接Eli-spot)。蓋上標準的 96孔板塑料板蓋，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時間(15-20小時)。這期間不要晃動或移動孔板。
9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。
11.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次。
12.于10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時30 分。
13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。
14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時。
15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。
16.每孔加入100ul BCIP/NBT。
17.室溫下反應5-15分鐘。*顯色后，將此液倒于相應的盤中。
18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點數。4℃下放置一 夜，點會比較明顯。此板在室溫下避光保存。